Individuazione di nuovi peptidi derivati dalla caseina del latte di capra in grado di migliorare l’insulino-resistenza indotta dall’elevato glucosio nelle cellule HepG2

Abstract

Durante questo studio abbiamo analizzato l’effetto degli idrolizzati della caseina del latte di capra sul tasso di consumo del glucosio, sulla concentrazione intracellulare di glicogeno e sull’espressione dell’mRNA di geni correlati alla gluconeogenesi, tra cui la fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 (PCK1) e la subunità catalitica glucosio-6-fosfatasi (G6PC), in cellule HepG2 insulino-resistenti. Dagli idrolizzati ottenuti, abbiamo anche purificato e caratterizzato nuovi peptidi in grado di migliorare l’insulino-resistenza indotta dall’elevato contenuto di glucosio nelle cellule HepG2. L’idrolizzato 3-h causava il tasso più elevato di consumo di glucosio nelle cellule HepG2 insulino-resistenti. Ha anche mostrato di avere effetti positivi sulla promozione della glicogenesi intracellulare e sulla riduzione dell’espressione dell’mRNA di PCK1 e G6PC. Abbiamo separato gli idrolizzati ottenuti in 3 frazioni (F1, F2 e F3) mediante cromatografia a filtrazione su gel e abbiamo ulteriormente purificato F1 utilizzando l’HPLC a fase inversa ed identificato i peptidi utilizzando la cromatografia liquida-spettrometria di massa tandem. I peptidi bioattivi identificati sono stati SDIPNPIGSE (αS1-caseina, f195-204), NPWDQVKR (αS2-caseina, f123-130), SLSSSEESITH (β-caseina, f30-40), e QEPVLGPVRGPFP (β-caseina, f207-219). I risultati da noi ottenuti indicano che specifici peptidi bioattivi provenienti dagli idrolizzati della caseina del latte di capra migliorano l’insulino-resistenza nelle cellule HepG2 che sono state trattate con un elevato quantitativo di glucosio. Questo risultato è un primo passo da cui partire per determinare se questi idrolizzati della caseina ottenuti dal latte di capra possono essere utilizzati come alimenti in grado di migliorare la resistenza all’insulina.

Introduzione

Circa 400 milioni di persone in tutto il mondo convivono con il diabete mellito di tipo 2, una malattia cronica che causa quasi 5 milioni di morti ogni anno. Si prevede che il numero di persone con diabete di tipo 2 raggiungerà i 640 milioni entro il 2040 (Matboli et al., 2018; Cheng et al., 2019). Le complicanze del diabete includono la retinopatia, la nefropatia e le malattie cardiovascolari, e rappresentano un grave rischio per la salute delle persone affette da questa patologia (Parsamanesh et al., 2018). Il fegato, che è il principale organo bersaglio dell’azione dell’insulina, controlla il metabolismo del glucosio regolando il suo stoccaggio (glicogenesi) e la sua produzione  (gluconeogenesi; Nocito et al., 2015; Yamaguchi et al., 2015). In circostanze normali, l’insulina si lega ai recettori epatici per far incrementare il consumo di glucosio e la glicogenesi al fine di mantenere stabili i livelli di glucosio nel sangue (Kubota et al., 2016). Tuttavia, quando la sensibilità all’insulina è compromessa, compare l’insulino-resistenza che, in ultima analisi, può portare ad un’alterazione dell’omeostasi energetica e al diabete di tipo 2 (Rungapamestry et al., 2012; Milburn e Lawton, 2013). Il miglioramento del quadro dell’insulino-resistenza è un metodo efficace per prevenire e trattare il diabete di tipo 2. Inoltre, va detto che quando la gluconeogenesi è regolata in maniera anomala, la produzione di glucosio aumenta, contribuendo all’iperglicemia (Kim et al., 2014; Sharabi et al., 2015). La fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 (codificata da PCK1) e la subunità catalitica della glucosio-6-fosfatasi (codificata da G6PC) sono enzimi chiave nella regolazione della gluconeogenesi (Ren et al., 2018). L’espressione della PCK1 e della G6PC è apparsa aumentata in un modello murino per l’obesità indotta dalla dieta e per l’insulino-resistenza (Meng et al., 2013). Sono disponibili vari farmaci per il trattamento del diabete di tipo 2. Tuttavia alcuni di questi, come i tiazolidinedioni e la metformina, possono avere effetti negativi poiché causano un aumento del peso, l’ipoglicemia e danni gastrointestinali (Dujic et al., 2016). Per la gestione e la prevenzione del diabete sono necessarie sostanze più sicure provenienti da fonti dietetiche naturali.

I peptidi bioattivi derivanti da proteine alimentari, come i peptidi antiossidanti delle uova, i peptidi antimicrobici dei legumi e i peptidi antipertensivi del miglio, possono avere potenziali benefici per la salute (Gressent et al., 2011; Nimalaratne et al., 2015; Chen et al., 2017). I peptidi derivati dal latte ottenuti dall’idrolisi o dalla fermentazione possiedono attività antipertensiva, antiossidante e antimicrobica (Kume et al., 2014; Jafar et al., 2018; Zanutto-Elgui et al., 2019). Inoltre è stato segnalato che questi peptidi possono avere anche un’azione anti diabetica e ipoglicemica. È stato dimostrato come questi peptidi siano capaci di inibire la dipeptidil-peptidasi 4 (DPP4), un enzima che può portare alla comparsa del diabete di tipo 2 (JuilleratJeanneret, 2014). L’enzima DPP4 cliva le incretine come il glucagone-like peptide 1 e il peptide insulinotropico glucosio-dipendente, ormoni rilasciati dall’intestino nel flusso sanguigno dopo l’ingestione del pasto per stimolare la secrezione di insulina e mantenere l’omeostasi del glucosio in tutto il corpo (Kim e Egan, 2008). I peptidi NLEIILR (β-LG, f71-77) e TQMVDEEIMEKFR (β-LG, f143-155) provenienti da idrolizzati di proteine del siero di giumenta hanno dimostrato di avere un’attività inibitoria sulla DPP4 e quindi un potenziale di utilizzo nella gestione del diabete di tipo 2 (Song et al., 2017a). Si è visto che alcuni peptidi inibitori della DPP4 provenienti dal latte bovino, come LPQNIPPL (β-CN, f70-77) e FLQP (β-CN, f87-90), sono in grado di prevenire il diabete di tipo 2 (Uenishi et al., 2012; Nongonierma et al., 2017). Recentemente, è molto cresciuto l’interesse verso il latte di capra, soprattutto visto il suo valore nutrizionale per la salute umana. La composizione aminoacidica del latte di capra è molto simile a quella del latte materno umano piuttosto che a quella del latte bovino, e può essere assorbito e digerito facilmente specialmente dai neonati (Carver, 2003; Inglingstad et al., 2010). Il latte di capra ha livelli elevati di AA essenziali, tra cui Thr, Ile, Lys, Cys, Tyr e Val (Haenlein, 2004). Inoltre, sono stati individuati peptidi bioattivi ad attività antiossidante, antibatterica e antitrombotica negli idrolizzati della caseina del latte di capra (Atanasova e Ivanova, 2010; Espejo-Carpio et al., 2013). Tuttavia, la ricerca relativa all’identificazione dei peptidi ottenuti dalla caseina del latte di capra e utili a migliorare l’insulino-resistenza è ancora limitata. Lo scopo di questo studio era quello di valutare gli effetti degli idrolizzati della caseina del latte di capra sul metabolismo del glucosio nelle cellule HepG2 insulino-resistenti, allo scopo di sviluppare nuovi alimenti funzionali per la prevenzione e il trattamento della resistenza all’insulina. Abbiamo studiato gli effetti insulino-sensibilizzanti degli idrolizzati della caseina del latte di capra utilizzando cellule HepG2 con resistenza all’insulina indotta da elevato glucosio. Inoltre abbiamo anche purificato ed identificato i peptidi che hanno migliorato l’insulino-resistenza.

Discussione

Il fegato è un importante organo bersaglio per l’azione dell’insulina: mantiene l’omeostasi sistemica del glucosio garantendo l’equilibrio tra glicogenesi (immagazzinamento del glucosio) e gluconeogenesi (produzione di glucosio). L’insulino-resistenza nel fegato è caratterizzata dall’insensibilità all’insulina, con conseguente iperglicemia e iperinsulinemia. Per studiare la resistenza all’insulina e il diabete di tipo 2 in vitro abbiamo impiegato cellule HepG2 derivate da epatociti umani. Un classico modello cellulare HepG2 insulino-resistente è generalmente utilizzato per indagare la patogenesi dell’insulino-resistenza e valutare gli effetti ipoglicemici delle sostanze bioattive di origine alimentare negli esperimenti in vitro (Boonloh et al., 2015). Abbiamo creato con successo un modello cellulare insulino-resistente esponendo le cellule ad elevati quantitativi di glucosio (30 mM) come descritto in uno studio precedente (Song et al., 2017b). Nel presente lavoro, gli idrolizzati della caseina del latte di capra favorivano l’utilizzo del glucosio e miglioravano la resistenza all’insulina nelle cellule HepG2 insulino-resistenti in vitro. Abbiamo scoperto che gli idrolizzati della caseina del latte di capra aumentano significativamente il tasso di consumo del glucosio e la concentrazione di glicogeno intracellulare, e diminuiscono l’espressione dell’mRNA di PCK1 e G6PC. Questi risultati ci indicano che specifici peptidi bioattivi derivanti dalla caseina del latte di capra contribuiscono a ridurre l’insulino-resistenza. In condizioni di insulino-resistenza, la sintesi del glicogeno viene soppressa, con conseguente aumento della produzione di glucosio epatico e della gluconeogenesi (Yan et al., 2016). La gluconeogenesi, una via inversa della glicolisi, sintetizza il glucosio libero a partire da carbonio non proveniente da fonti di carboidrati per mantenere adeguati i livelli di glucosio nel sangue durante la fame o l’esercizio fisico intenso (Wang e Dong, 2019). Nelle persone affette da diabete di tipo 2, la gluconeogenesi è eccessivamente aumentata e deve essere inibita (van Deursen et al., 2008). La fosfoenolpiruvato carbossichinasi 1 (PCK1) e la subunità catalitica della glucosio-6-fosfatasi (G6PC) sono enzimi chiave nella regolazione della gluconeogenesi. Vari studi hanno accertato che la diminuzione dell’espressione dell’mRNA della PCK1 migliora sia l’iperglicemia che l’insulino-resistenza, dimostrando così che l’inibizione della gluconeogenesi potrebbe essere un obiettivo terapeutico per il trattamento dell’insulino-resistenza e sarebbe potenzialmente utile per il trattamento del diabete di tipo 2 (Gómez-Valadés et al., 2006). Ad oggi, nei modelli sperimentali cellulari, si è visto che vari peptidi derivati dal latte possiedono attività anti-diabetica (Newsholme et al., 2006). Nelle cellule insulino-resistenti HepG2 il peptide IPPKKNQDKTE, individuato a partire dagli idrolizzati del glicomacropeptide derivato dalla caseina, ha mostrato di avere un effetto positivo sul consumo di glucosio e sulla concentrazione intracellulare di glicogeno in maniera dose-dipendente (Song et al., 2017b). In questo studio, rispetto a quello sul gruppo ad elevato contenuto di glucosio, la soppressione dell’espressione dell’mRNA della G6PC e della PCK1 nelle cellule HepG2 insulino-resistenti da parte degli idrolizzati della caseina del latte di capra era, rispettivamente, del 34.75 e del 27.16%. Un nostro studio precedente ha mostrato che il peptide  IPPKKNQDKTE derivante dal glicomacropeptide della caseina diminuiva l’espressione dell’mRNA della G6PC e PCK1 del 36.06 e del 73.97%, rispettivamente (Song et al., 2017b). Nel presente studio, abbiamo purificato 4 peptidi in grado di migliorare l’insulino-resistenza partendo da idrolizzati della caseina del latte di capra: SDIPNPIGSE (αS1-CN, f195-204), NPWDQVKR (αS2-CN, f123-130), SLSSSEESITH (β-CN, f30-40) e QEPVLGPVRGPFP (β-CN, f207-219). Le sequenze peptidiche contenenti Gly e Pro giocano un ruolo importante nel miglioramento della sensibilità all’insulina (Lyapina et al., 2013; Malininin et al., 2014). Coerentemente con questi risultati, nel presente studio il SDIPNPIGSE ottenuto da idrolizzati della αS1-CN e il QEPVLGPVRGPFP ottenuto da idrolizzati della β-CN contenevano Gly e Pro, che potrebbero andare a migliorare l’insulino-resistenza. Inoltre, la DPP4 è un potenziale sito di legame per la sequenza aminoacidica di peptidi anti-diabetici, che potrebbe andare a migliorare la sensibilità insulinica (Nongonierma e Fitzgerald, 2013). I peptidi inibitori della DPP4 sono rappresentati da AA idrofobici che includono Tyr, Trp, Val, Met, Ile, Leu e Phe (Zhang et al., 2015). Tra i peptidi identificati nel presente studio, SDIPNPIGSE ottenuto da idrolizzati di αS1-CN conteneva l’AA idrofobico Ile e NPWDQVKR ottenuto da idrolizzati di αS2-CN conteneva gli AA idrofobici Val e Trp. Inoltre, Ile, Leu e Val erano presenti nelle sequenze di SLSSSEESITH e QEPVLGPVRGPFP, derivate da idrolizzati della β-CN di capra. Anche le sequenze Ser-Leu, Ile-Pro e Phe-Pro mostravano avere un’attività inibitoria sulla DPP4 (Patil et al., 2015). Quando la Pro è presente a livello di residuo N-terminale o di residuo C-terminale, in particolare a livello di secondo, terzo o quarto residuo N-terminale, il peptide mostra una potenziale attività inibitoria della DPP4 (Lacroix e Li-Chan, 2014; Nongonierma e Fitzgerald, 2014; Harnedy et al., 2015). In accordo con questi report, i peptidi identificati nel presente studio contenevano residui Ser-Leu, Ile-Pro o Phe-Pro, mettendo in evidenza la loro capacità di poter migliorare la resistenza all’insulina. I peptidi NPWDQVKR e QEPVLGPVRGPFP del presente studio avevano Pro al secondo o terzo residuo N-terminale e SDIPNPIGSE, ottenuto da idrolizzati dell’αS1-CN, aveva Pro al quarto residuo N-terminale. Questi 4 peptidi identificati a partire da idrolizzati del latte di capra hanno mostrato la loro potenziale capacità di andare a migliorare l’insulino-resistenza nelle cellule HepG2.

Conclusioni

Gli idrolizzati della caseina contenuta nel latte di capra possiedono la capacità di migliorare significativamente il metabolismo del glucosio, incrementando il tasso di consumo del glucosio e la concentrazione intracellulare di glicogeno e diminuendo l’espressione dell’mRNA di PCK1 e G6PC. Abbiamo isolato 4 nuovi peptidi in grado di  migliorare l’insulino-resistenza: SDIPNPIGSE (αS1-CN, f195-204), NPWDQVKR (αS2-CN, f123-130), SLSSSEESITH (β-CN, f30-40) e QEPVLGPVRGPFP (β-CN, f207-219). I  risultati ottenuti ci suggeriscono come gli idrolizzati della caseina del latte di capra abbiano il potenziale di migliorare l’insulino-resistenza e di aiutarci nella gestione del diabete di tipo 2. Sono raccomandati studi in modelli animali.

Ringraziamenti

Questo lavoro è stato sovvenzionato dalla National Natural Science Foundation of China (Beijing, Cina; sovvenzione n. 31871806), dal National Key Research and Development Program of China (Beijing; 2019YFC1605000) e dal Beijing Dairy Industry Innovation Team (BAIC06-2020). Ringraziamo anche Thomas A. Gavin, professore emerito della Cornell University (Ithaca, NY) per averci aiutato nella redazione di questo articolo. Gli autori hanno dichiarato l’assenza di qualsiasi  conflitto di interessi.

 

Identification of novel peptides from goat milk casein that ameliorate high-glucose-induced insulin resistance in HepG2 cells

H. Gong, J. Gao, Y. Wang, Q. W. Luo, K. R. Guo, F. Z. Ren, and X. Y. Mao*

Beijing Advanced Innovation Center for Food Nutrition and Human Health, College of Food Science and Nutritional Engineering, Key Laboratory of Functional Dairy, China Agricultural University, Beijing 100083, Repubblica Popolare Cinese

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