Il settore dell’allevamento bufalino, da diversi anni a questa parte, sta crescendo con un trend abbastanza elevato, date le richieste da parte dei mercati nazionali ed internazionali. Per rispondere a tali necessità gli allevatori stanno gradualmente aumentando il livello generale della gestione aziendale, perfezionando la sfera riproduttiva perché, come si sa: “se non c’è riproduzione, non c’è produzione!”.

Di conseguenza, anche l’attività del medico veterinario ha dovuto elevare i suoi standard rispetto al passato, utilizzando strumenti e protocolli scientificamente validi e che diano un’elevata garanzia di risultato. È proprio in questo contesto che trova spazio lo studio Eco-Color Doppler del corpo luteo nei giorni immediatamente successivi all’inseminazione strumentale.

Il corpo luteo, struttura che deriva dal follicolo ovarico andato incontro ad ovulazione, grazie alla sua produzione di progesterone permette lo sviluppo dello stato gravidico a partire dai primi sostentamenti embrionali, passando per l’impianto uterino, fino alla completa placentazione. Un corpo luteo attivo e funzionante è quindi uno degli elementi che più incidono sull’instaurarsi di uno stato di gravidanza. Sebbene ci siano diverse possibili cause di riassorbimento fetale o aborto, l’ipofunzionalità luteinica è senza dubbio il fattore endogeno più importante e determinante nell’immediato periodo post-fecondazione.

Lo studio ecografico dell’apparato genitale in ambito buiatrico, ed in particolare nel settore bufalino, prevede comunemente l’utilizzo della modalità B-Mode, la quale permette di effettuare una valutazione morfologica delle strutture poste in esame. Il suo utilizzo avviene principalmente in due momenti: prima della fecondazione (per avere informazioni sulla ripresa del ciclo ovarico post-partum e sull’eventuale prossimità dell’evento ovulatorio) e dopo almeno 26-27 giorni dall’inseminazione, quando è possibile effettuare una precoce diagnosi di gravidanza rilevando la presenza embrionale. In questo contesto, l’Eco-Color Dopler trova un punto vuoto in cui inserirsi, data la mancanza di dati standardizzati nella specie riguardo gli indici di flusso e data la soggettività nell’interpretazione del dato grafico da parte del medico veterinario che conduce lo studio.

Diversi studi sono già stati effettuati sulla bufala, studiando le caratteristiche morfologiche e funzionali del corpo luteo ed indagando, in particolare, quale potesse essere il periodo chiave che più si addice ad esser preso come finestra di studio discriminante riguardo la futura diagnosi di gravidanza accertata con ecografia tradizionale dopo il trentesimo giorno dalla fecondazione. In particolar modo, si è visto come la finestra temporale che va dai 5 ai 10 giorni post-fecondazione sia un periodo critico per il futuro instaurarsi della gravidanza (Neglia et al., 2015).

Alla luce di queste considerazioni, un vasto team di ricerca, coordinato dal Prof. Giuseppe Campanile e composto da docenti, ricercatori e studenti, del Dipartimento di Medicina Veterinaria e Produzioni Animali, dell’Università degli Studi di Napoli “Federico II”, ha portato a termine a giugno del 2020 un lavoro scientifico sperimentale (Salzano et al., 2020) che per la prima volta in campo bufalino ha analizzato le dimensioni dell’area di vascolarizzazione luteinica, a partire dalle immagini ottenute tramite ecografia color-doppler durante il periodo critico (5-10 giorni post inseminazione strumentale).

Lo scopo ultimo del lavoro era proprio quello di cercare dei dati certi ed oggettivi per l’interpretazione delle immagini ottenute, al fine di valutare la funzionalità luteinica e predire la successiva diagnosi di gravidanza. Per essere più precisi, l’interesse ultimo dell’allevatore, e del medico veterinario, in questa finestra temporale non è tanto quello di appurare lo stato gravidico dell’animale, quanto quello di accertarsi il più presto possibile dell’eventuale fallimento del tentativo fecondante, al fine di risincronizzare subito l’animale e ridurre al minimo l’allungamento del periodo inter-parto ed i costi di gestione del singolo capo.

Organizzazione dello studio

Lo studio ha coinvolto 59 bufale pluripare di razza Mediterranea Italiana le quali sono state sincronizzate ed inseminate artificialmente con protocollo Ovsynch-TAI (Neglia et al., 2016). Successivamente, su ogni animale, è stato effettuato uno studio ecografico in B-Mode ed in Eco-Color Doppler Mode quotidianamente, dal quinto al decimo giorno post-inseminazione strumentale. Inoltre, nella stessa finestra temporale, è stato prelevato quotidianamente un campione di sangue per ogni animale su cui è stata quantificata la progesteronemia (P4).

Le immagini ottenute ecograficamente sono state analizzate con un software open source chiamato Image J grazie al quale sono stati ottenuti dati riguardanti l’area del corpo luteo (Corpus Luteum Size; CLS) e l’area di vascolarizzazione del Corpo Luteo (Blood Flow Area; BFA). Successivamente, a 45 e 70 giorni dalla fecondazione è stata effettuata la diagnosi di gravidanza tramite ecografia tradizionale. Alla luce di tutti i dati ottenuti (CLS, BFA, P4 e stato di gravidanza) sono state effettuate retrospettivamente delle analisi statistiche volte a rivelare eventuali correlazioni tra CLS, BFA e P4 con lo stato gravidico dell’animale.

Image J può essere usato routinariamente?

L’importanza dei dati scientifici ottenibili tramite studi e sperimentazioni è l’insieme dell’affidabilità del risultato unita alla possibilità economico-pratica di applicare tali indicazioni nella clinica di routine. Proprio per questo è stato scelto di utilizzare un software di analisi delle immagini semplice, pratico e gratuito come Image J. La ricerca di una metodica facile e sostenibile, però, non si è fermata solo all’uso di un software open source. E’ stato infatti ritenuto di primaria importanza riuscire ad effettuare un’analisi delle immagini rapida, immediata e semplice che potesse essere facilmente replicata in poco tempo da qualsiasi medico veterinario o tecnico-zoonomo che gestisca i dati manageriali delle mandrie in allevamento. Inizialmente, infatti, la tecnica utilizzata per calcolare l’area di vascolarizzazione prevedeva una banale, ma non immediata, selezione manuale delle aree “colorate” (escludendo gli artefatti) e, assegnando l’unità di misura corretta, il software calcolava la misura richiesta. Successivamente, però, è stato possibile velocizzare moltissimo la procedura sfruttando una funzionalità del programma attraverso cui è possibile selezionare automaticamente le aree colorate (Figura 1).

Figura 1. Valutazione della vascolarizzazione del Corpo Luteo attraverso il software Image J. Nella figura (A) il flusso sanguigno del Corpo Luteo esaminato tramite Eco-Color Doppler mode e nella figura (B) la stessa figura durante l’analisi di post-processazione con l’aiuto del software.

Analisi statistiche e risultati principali

Per lo studio statistico dei dati ottenuti sono stati retrospettivamente creati due gruppi di animali: gravidi (n=29) e non gravidi (n=30). È stata effettuata un’analisi ANOVA per misure ripetute riguardo i parametri BSA, CLS e P4, valutando le differenze tra i diversi gruppi nei diversi giorni e tra i diversi giorni nello stesso gruppo. L’analisi è proseguita effettuando degli studi di regressione lineare utilizzando i parametri BFA, CLS, P4 e DIM (days in milk; giorni in lattazione) come variabili indipendenti e valutando la loro relazione con CLS, BFA, e P4 nei gruppi: gravide, non gravide e tutti gli animali.

La regressione logistica valutante lo stato di gravidanza è stata calcolata utilizzando CLS, BFA, P4, DIM e BCS (Body Condition Score; indice di condizione corporea) come variabili indipendenti, per valutare se una di esse potesse essere usata per predire, appunto, lo stato di gravidanza. Infine, è stata effettuata un’analisi di tipo ROC, focalizzandosi su tre caratteristiche (CLS, BFA e P4) per indentificare il valore ottimale di “cutoff” per predire la gravidanza, valutandone anche la sensibilità e la specificità.

I risultati hanno mostrato che il primo parametro a differenziarsi, tra gravide e non, è stato il P4 dal giorno 7 post inseminazione strumentale, seguito dal BFA al giorno 8. Curioso è il dato che dimostra che sia P4 che BFA si accrescano in entrambi i gruppi col passare dei giorni ed, improvvisamente, calino negli animali non gravidi a partire dal giorno 9. Inoltre, il valore medio di BFA nei 6 giorni presi in esame si è rivelato maggiore del 50% nelle gravide rispetto alle non gravide, mentre i valori medi di CLS e P4 erano rispettivamente superiori del 16% e 29% nelle gravide rispetto alle non gravide. Infine, l’analisi ROC ha individuato il valore P4 come discriminante lo stato di gravidanza già dal giorno 5, con un picco in sensibilità e specificità al giorno 10 (85.2% e 81.8% rispettivamente). Il valore BFA ha iniziato a mostrarsi discriminante dal giorno 9, con una sensibilità del 70.4% e specificità del 59.1%.

Conclusioni

Questo studio pare aprire le porte in maniera decisamente favorevole ed ottimista all’uso dell’Eco-Color Doppler e alla successiva analisi delle immagini ottenute. La valutazione del BFA risulta nettamente differente tra animali successivamente gravidi e non; questo è da considerarsi soprattutto in relazione al parametro CLS che, invece, non mostra differenze significative se non nel primo giorno analizzato (giorno 5). Pare chiaro ed evidente, che la strada da percorrere per ottenere una diagnosi precoce di gravidanza debba necessariamente passare per lo studio funzionale del corpo luteo e non solo morfologico. L’ecografia in B-Mode, infatti, permette di valutare la morfologia e calcolare le dimensioni dell’area luteinica ma questa non pere mostrarsi correlata né allo stato gravidico, né, soprattutto, alla vascolarizzazione. Inoltre, è fondamentale tenere conto del trend negativo assunto dai valori di BFA e P4 a partire dal giorno 9 nelle bufale non gravide. Questo dato lascia ben sperare, permettendo di supporre che è proprio in quel frangente che accadono decisive ed irreversibili modifiche alla funzionalità luteinica, le quali influenzano inesorabilmente le sorti del precedente evento fecondante.

In conclusione, nonostante la grande difficoltà nel riuscire a standardizzare dei parametri vascolari, rilevati in condizioni non sempre comode e facili, come quelle di un allevamento bufalino, i risultati di questo studio sembrano indicare che la strada da percorrere per arrivare ad una diagnosi sempre più precoce della gravidanza in questa specie debba necessariamente passare per lo studio della funzionalità del Corpo Luteo.

Bibliografia

  • Neglia G, Restucci B, Russo M, Vecchio D, Gasparrini B, Alberto P, et al. Early development and function of the corpus luteum and relationship to pregnancy in the buffalo. Theriogenology (2015) 83:959–967. doi: 10.1016/j.theriogenology.2014.11.035.
  • Neglia G, Gasparrini B, Salzano A, Vecchio D, De Carlo E, Cimmino R, et al. Relationship between the ovarian follicular response at the start of an Ovsynch-TAI program and pregnancy outcome in the Mediterranean river buffalo. Theriogenology (2016) 86:2328e33. doi: 10.1016/j.theriogenology.2016.07.027.
  • Salzano A, Russo M, Anglani G, Licitra F, Zullo G, Cotticelli A, Fatone G, Campanile G. Early prediction of corpus luteum functionality using an imaging Software. Frontiers in Veterinary Science (2020) 7:299. doi: 10.3389/fvets.2020.00299.

 

Autori: Giuseppe Anglani e Angela Salzano

Sinossi del lavoro: Salzano A, Russo M, Anglani G, Licitra F, Zullo G, Cotticelli A, Fatone G, Campanile G., “Early prediction of corpus luteum functionality using an imaging Software”. Frontiers in Veterinary Science (2020) 7:299. doi: 10.3389/fvets.2020.00299.