L’alimentazione rappresenta nell’uomo una delle principali cause predisponenti o scatenanti di patologie metaboliche e neoplastiche attraverso una non corretta valutazione dei principi nutritivi e del corretto rapporto tra molecole funzionali e disfunzionali.

Uno dei principali obiettivi della zootecnia odierna è quello di mettere a punto un sistema integrato che mira alla produzione di alimenti funzionali che presentano spiccate capacità di prevenzione delle principali patologie metaboliche e neoplastiche.

Il futuro della prevenzione deve passare attraverso uno sviluppo di eventi produttivi che entrano nell’ottica della One-health e, pertanto, è necessario intervenire sulle tecniche di produzione degli alimenti al fine di ampliare la conoscenza delle molecole funzionali e disfunzionali e modificare, attraverso le tecniche di produzione, il loro rapporto.

I consumatori hanno iniziato a richiedere cibi “naturali”, e ciò potrebbe essere reso possibile modificando direttamente la composizione del latte già in azienda attraverso l’intervento dietetico, senza ricorrere a modifiche meccaniche.

Diversi studi scientifici hanno dimostrato che la presenza del pascolo può influenzare positivamente il profilo nutrizionale del latte, migliorando la concentrazione di diversi composti benefici come gli acidi grassi polinsaturi Omega-3, l’acido vaccenico, l’acido linolenico e l’acido linoleico coniugato (CLA), oltre a ridurre i livelli di acidi grassi Omega-6 e acido palmitico (Marìn et al., 2018; Zhang et al., 2019).

Quando non è possibile utilizzare il pascolo, l’impiego di foraggio verde potrebbe rappresentare un’opportunità a basso costo.

Nel caso della specie bufalina, finora sono state condotte poche ricerche molecolari, sfruttando il sequenziamento dell’RNA (RNA-seq) e altre tecniche omiche (Arora et al, 2019; Deng et al., 2019), e non sono disponibili molte informazioni sull’impatto di diversi regimi alimentari a livello trascrizionale nel rumine in questa specie.

In uno studio precedente (Salzano et al., 2021), è stato dimostrato che l’assunzione di foraggio verde nelle bufale da latte mediterranee italiane ha potenziato l’attività antiossidante e antineoplastica del latte di bufala.

Sulla base di questa evidenza, si è dunque ipotizzato che la somministrazione di foraggio verde nelle bufale da latte mediterranee italiane induca nel rumine cambiamenti nell’espressione genica i cui prodotti partecipano al metabolismo di importanti biomolecole nel latte.

Lo scopo del presente studio, durato 60 giorni, è stato pertanto quello di identificare nel rumine l’impatto della dieta a base di foraggio verde sui meccanismi molecolari rilevanti per la funzionalità e la fisiologia del rumine, attraverso l’analisi dei profili trascrizionali ruminali delle bufale.

Sono stati pertanto creati due gruppi, il primo, controllo (n=6), che ha ricevuto una razione mista totale standard (TMR) e un secondo, trattato (n=6) che invece è stato alimentato con TMR + foraggio verde di loietto (30% della dieta). Le due diete erano isoproteiche e isoenergetiche. Sono stati poi raccolti campioni di tessuto ruminale e su questi è stato effettuato l’isolamento dell’RNA totale, la purificazione, l’elaborazione e mappatura delle reads, l’identificazione, l’analisi funzionale e la validazione tramite pcr dei geni differenzialmente espressi selezionati.

L’analisi ha prodotto una media di 48 milioni di reads, che sono state poi mappate sulla sequenza di riferimento del genoma bufalino (Bubalus Bubalis) e si è avuto avuto come risultato che l’espressione dei geni nel Gruppo trattato e nel Gruppo controllo era sovrapponibile.

I campioni di RNA sono stati, quindi, sottoposti a sequenziamento su larga scala (sequenziamento paired-end, 2×150 basi, 30 milioni di read).

Successivamente, al fine di identificare le regioni genomiche espresse, le read di buona qualità sono state allineate contro il genoma di riferimento di Bubalus bubalis (versione UOA_WB_1, NCBI) mediante l’utilizzo del software STAR aligner (version 2.5.2b). Per ciascun campione, l’84% circa delle read è stato mappato in maniera univoca. Per i geni con una variazione significativa di espressione è stata effettuata una Gene Ontology Enrichment Analysis (GOEA), al fine di individuare le categorie GO più arricchite di geni down-regolati e up-regolati. Per convalidare i risultati dell’RNA-seq, i geni differenzialmente espressi (DEG) sono stati selezionati in modo casuale e analizzati tramite retrotrascrizione qPCR (RT-qPCR).

Per quanto riguarda i risultati, l’analisi iniziale dei DEG eseguita con EdgeR con valori p corretti dall’FDR < 0,05 come soglia di significatività non ha prodotto DEG significativi. Considerando che le due diete erano isonitrogene e isoenergetiche e variavano solo per l’inclusione del foraggio verde, erano attese solo piccole variazioni nell’espressione genica a seguito del cambiamento della dieta, che potrebbero essere mascherate dalla variabilità interindividuale degli animali appartenenti allo stesso gruppo.

Alla luce di questa ipotesi, è stato deciso di identificare i DEG utilizzando valori p nominali < 0,05 come soglia di significatività. Questa analisi ha identificato 155 DEG (Figura 1a). Tra i DEG, 71 geni hanno mostrato una minore espressione e 84 hanno mostrato una maggiore espressione nel rumine delle bufale trattate (Fig. 1a, parte inferiore).

Figura 1 – Effetto del foraggio verde sul profilo trascrizionale nel rumine delle bufale da latte (sei animali per ciascuna condizione), identificato utilizzando EdgeR (valori p nominali < 0,05). a Parte superiore: Grafico a forma di vulcano che illustra i geni differenzialmente espressi (DEG) nel rumine. I punti rossi e verdi rappresentano i geni significativamente sovra-regolati e sottoregolati nelle bufale trattate rispetto al controllo; i punti neri sono geni il cui livello di espressione non ha raggiunto la significatività statistica (valore p < 0,05) tra i due gruppi sperimentali. b Rappresentazione tramite heatmap dei DEG significativi (155) in tutti i campioni. La scala di colore blu-rosso mostra i livelli di espressione bassi e alti per ciascun gene.

Per convalidare la differenziazione nell’espressione osservata tramite l’analisi RNA-seq, l’espressione dei geni differenzialmente espressi (DEG) selezionati in modo casuale identificati con il pacchetto software EdgeR è stata analizzata nel rumine delle bufale trattate e di controllo mediante RT-qPCR, utilizzando gli stessi campioni analizzati con l’RNA-seq. Sono stati analizzati i livelli di espressione di 12 DEG. Per tutti i 12 geni identificati con il tool EdgeR (valori p nominali < 0,05), i test rt-qPCR hanno mostrato un pattern di espressione concordante con i risultati dell’RNA-seq.

L’Analisi dell’Arricchimento dell’Ontologia Genica (GOEA) è stata condotta sui 155 DEG tra le bufale trattate e di controllo, identificati utilizzando il tool EdgeR.

Il 35% (68) dei termini GO arricchiti nei geni sovra-regolati è stato classificato come funzione molecolare, il 17% (33) come componente cellulare e il 48% (94) come processo biologico. Il 38% (89) dei termini GO arricchiti nei geni sottoregolati è stato categorizzato come funzione molecolare, il 22% (51) come componente cellulare e il 40% (96) come processo biologico (Figura 2).

Figura 2 – Analisi dell’arricchimento dell’ontologia genica dei geni differenzialmente espressi. Vengono mostrati i termini GO selezionati, arricchiti nei geni (a) sovra-regolati e (b) sottoregolati nel rumine delle bufale alimentate con TMR + foraggio verde (Trattate) in confronto a quelle alimentate con la dieta TMR (Controllo). I termini GO sono stati classificati come funzione molecolare (barre viola), componente cellulare (barre verdi) e processo biologico (barre blu).

L’ulteriore analisi dei singoli geni che sono risultati differenzialmente espressi nel rumine delle bufale da latte trattate in confronto agli animali di controllo, utilizzando EdgeR con valori p nominali < 0,05, ci ha permesso di mettere in evidenza le variazioni nella trascrizione genica nei geni coinvolti in processi biologici rilevanti per la funzionalità e la fisiologia del rumine, e quindi per il benessere degli animali e la produzione (Figura 3).

Figura 3 – Dati trascrittomici dell’espressione differenziale dei geni coinvolti in processi biologici selezionati. I boxplot illustrano i valori di espressione del Trimmed Mean of M values (TMM) dei geni selezionati deregolati nel rumine delle bufale da latte alimentate con TMR + foraggio verde (Trattate) rispetto agli animali alimentati con la dieta TMR (Controllo) e relativi al metabolismo dell’energia, dei lipidi o degli aminoacidi (a), al sistema immunitario e all’infiammazione (b), allo stress ossidativo e alla risposta cellulare allo stress (c), all’organizzazione della matrice extracellulare (d) e alla struttura e alla funzione muscolare (e). Le linee orizzontali all’interno di ciascun box indicano le mediane, i “whiskers” mostrano i percentili dal 5% al 95% degli intervalli di confidenza, e gli outlier sono mostrati come punti. * valore p < 0,05; ** valore p < 0,01; *** valore p < 0,001.

I dati di RNA-seq, ottenuti utilizzando il software EdgeR, hanno indicato che il foraggio verde ha avuto un impatto sull’espressione di diversi geni che codificano per fattori implicati nella regolazione di processi biologici rilevanti per il benessere dei bufali, come quelli legati alla risposta cellulare allo stress, al sistema immunitario e all’infiammazione, nonché geni che codificano per fattori coinvolti nella funzionalità del rumine, come la struttura/funzione muscolare e il metabolismo degli aminoacidi e dei lipidi.

Questa evidenza suggerisce un potenziamento dell’attività del rumine mediante il foraggio verde e permette di ipotizzare un ruolo di questa dieta nella produzione di molecole nutraceutiche, le cui concentrazioni potrebbero essere aumentate anche nel latte.

In precedenza è stato dimostrato che il 30% di foraggio verde è in grado di aumentare la concentrazione di biomolecole benefiche, tra cui betaine e carnitine, nel latte e in altri prodotti lattiero-caseari nella specie bufalina (Salzano et al., 2021; Salzano et al., 2019).

Nel presente studio, il foraggio verde ha modulato l’espressione di geni legati al metabolismo degli aminoacidi, tra cui quelli legati al metabolismo della cisteina/metionina, serina e lisina.

Tra i geni implicati nel metabolismo lipidico vi è l’up-regulation di HSD17B13, che codifica l’enzima 17-beta-idrossisteroido-deidrogenasi tipo 13, che si ipotizza possa essere coinvolto nel metabolismo degli acidi grassi (Su et al., 2019), anche se questo rimane controverso.

È possibile che l’aumentata espressione di HSD17B13 nelle bufale che hanno ricevuto il foraggio verde abbia stimolato la β-ossidazione degli acidi grassi, influenzando il trasporto dell’acil-carnitina nei mitocondri. Inoltre, è interessante notare che HSD17B13 ha anche un ruolo antinfiammatorio, poiché la sua carenza scatena steatosi epatica e infiammazione nei topi (Adam et al., 2018).

Il foraggio verde sembra influire anche sul metabolismo energetico. Abbiamo infatti trovato l’up-regulation di ARFGEF3, che codifica per la proteina BIG3 (Brefeldin A-inhibited guanine nucleotide-exchange protein 3), che partecipa alla regolazione dell’omeostasi del glucosio sistemico, attraverso la regolazione della secrezione di insulina e glucagone (Li et al., 2015; Li et al., 2014).

Il foraggio verde esercita inoltre un impatto positivo sul sistema immunitario, attraverso la modulazione dell’espressione di geni che codificano per fattori implicati nella risposta immunitaria e nell’infiammazione. È stata riscontrata un’up-regulation dei geni IFI27, IFI27L2, TRIM14, DUOXA1, DUOX1, IGFBP6 e SLURP1.

I geni IFI27 e IFI27L2 codificano due fattori appartenenti alla famiglia delle proteine indotte dall’interferone, che sono coinvolti sia nella risposta immunitaria innata (Cheriyat et al., 2011) che nel metabolismo energetico (Jin et al., 2018). TRIM14 codifica una proteina appartenente alla famiglia TRIM, nota anche per promuovere la difesa dell’organismo contro le infezioni virali (Giraldo et al., 2020).

È noto che la funzionalità del rumine dipende dalla composizione del microbiota. La comunicazione tra il microbiota del rumine e le cellule immunitarie innate nell’epitelio ruminale può contribuire all’equilibrio tra tolleranza immunitaria e risposta infiammatoria nel rumine, che dipende in parte dai metaboliti e quindi dalla dieta (Minuti et al., 2015; Shen et al., 2017).

E’ stato riscontrato che il foraggio verde ha modulato l’espressione di molti geni con un ruolo nell’infiammazione. Tra i geni down-regolati, abbiamo trovato SAAL1, ROR2, SMOC2 e S100A11, che sono associati all’attività pro-infiammatoria (Sato et al., 2011; Zhang et al., 2020). Il foraggio verde ha indotto cambiamenti nell’espressione di geni legati allo stress ossidativo e alla risposta cellulare allo stress.

Particolarmente notevole è stata l’individuazione dell’up-regulation di geni il cui prodotto contrasta le condizioni stressanti, come i geni NUDT18, DNAJA4 e HSF4. Inoltre, è stata riscontrata una down-regulation di geni che codificano per fattori coinvolti nella risposta cellulare alla detossificazione, come UGT1A9, MRP4/ABCC4 e CYP1A1, che potrebbero derivare dalla natura salutare del foraggio verde.

La matrice extracellulare svolge un ruolo cruciale nella proliferazione, differenziazione, adesione e infiammazione. I risultati di questo studio permettono di ipotizzare che il foraggio verde influenzi la modellazione della matrice extracellulare e quindi l’organizzazione della struttura e la funzione delle cellule.

I bufali che hanno ricevuto il foraggio verde hanno mostrato cambiamenti nell’espressione di molti geni che codificano per fattori associati alla struttura e alla funzione muscolare. Di particolare interesse è l’aumento dell’espressione dei geni KCNK10, CACNG4 e ATP2B4, che codificano per fattori che modulano l’omeostasi del Ca2+ (Afzali et al., 2016; Kious et al., 2002), un secondo messaggero importante per la contrazione e la differenziazione muscolare, il che fa supporre che il foraggio verde potrebbe stimolare la funzione muscolare del rumine.

Inoltre, il foraggio verde ha modulato, in direzioni diverse, geni che codificano per componenti strutturali del citoscheletro, come MYH11, DES e TUBA1D, e fattori che ne promuovono l’assemblaggio, come TPPP, TPPP3, suggerendo quindi un impatto di questa dieta sulla struttura muscolare.

Sebbene la bassa potenza statistica dello studio suggerisca una limitazione di questo lavoro e evidenzi la necessità di ulteriori indagini, viene fornita per la prima volta, una panoramica completa dei diversi processi biologici che sembrano essere influenzati dalla dieta a base di foraggio verde nell’epitelio ruminale delle bufale.

Questo lavoro aggiunge una conoscenza potenziale sugli effetti della dieta sui processi molecolari legati al benessere degli animali e alla produzione di molecole nutraceutiche. Queste scoperte apriranno la strada all’ottimizzazione di nuove strategie basate sul sistema di alimentazione di precisione, rispettoso delle esigenze etologiche e fisiologiche degli animali.

Tuttavia, sono necessari ulteriori studi per confermare ulteriormente l’impatto del foraggio verde sul programma trascrizionale del rumine, possibilmente attraverso la convalida di ulteriori DEG qui identificati e l’aumento delle dimensioni del campione. Inoltre, ulteriori indagini omiche, comprese le ricerche metilomiche, potrebbero consentire di decifrare l’impatto molecolare del foraggio verde a più livelli.

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Sinossi di: Salzano A, Fioriniello S, D’Onofrio N, Balestrieri Ml, Aiese Cigliano R, Neglia G, Della Ragione F, Campanile G. “Transcriptomic profiles of the ruminal wall in Italian Mediterranean dairy buffaloes fed green forage“. BMC Genomics. 2023;24(1):133. doi: 10.1186/s12864-023-09215-6.

A cura di: Federica D’Acierno e Angela Salzano