Listeria monocytogenes: una nuova strategia per la sua inibizione, basata sull’utilizzo di un enzima microbico

Introduzione

Listeria monocytogenes è un microrganismo ubiquitario, facoltativo anaerobio che cresce a temperature di refrigerazione. Il patogeno è stato trovato nell’ambiente, in particolare in terreno e acqua. L. monocytogenes può sopravvivere nel cibo che ha un contenuto relativamente alto di acidità e salinità e può essere tollerante ad alte e basse temperature. Data la sua natura ubiquitaria, e i composti con cui si può nutrire all’interno dei prodotti lattiero-caseari, L. monocytogenes è un patogeno preoccupante per i casari. Può contaminare tank di latte provenendo dalla mammella delle vacche o dalla strumentazione di mungitura. Può contaminare prodotti a latte crudo, ma può anche contaminare prodotti pastorizzati a causa dell’ambiente contaminato del caseificio dove può sopravvivere per anni, così da renderlo un posto pericoloso per i prodotti crudi e pastorizzati.

L’ingestione di L. monocytogenes ha la potenzialità di causare la patologia della listeriosi tra bambini, individui immunodepressi, donne incinte e anziani. Studi epidemiologici negli USA hanno dimostrato che L. monocytogenes ha uno dei più alti tassi di fatalità tra i patogeni alimentari, rendendo pericoloso per la società se negli impianti di trasformazione alimentare sono applicati protocolli impropri. È stato stimato che a livello mondiale la somma dei casi di listeriosi è pari a 23.150 di cui 5.463 morti nel 2010. Negli USA, i prodotti lattiero-caseari, come i formaggi freschi, i formaggi duri, e i formaggi a pasta molle sono i più comunemente associati con contaminazione da L. monocytogenes. Inoltre, ci sono state 7 ondate negli USA causate da questo patogeno a partire dal 2011.

In generale, la contaminazione di formaggi a pasta molle e freschi con L. monocytogenes continua ad accadere, dato che questo tipo di formaggi ha un basso livello di sale, un pH quasi neutrale, e alta attività dell’acqua (aW). Quindi, se contamina dopo la pastorizzazione, L. monocytogenes può essere più pericoloso.

In aggiunta ai formaggi freschi, L. monocytogenes può costituire una minaccia per i formaggi a base di latte crudo. Negli Stati Uniti, i formaggi a base di latte non pastorizzato devono essere stagionati ad una temperatura di almeno 1,7 °C per 60 giorni prima della distribuzione. In una valutazione dei rischi del latte crudo, tra i formaggio a pasta molle, la Food and Drug Administration statunitense ha predetto che il 4,7% dei formaggi era contaminato da L. monocytogenes. Secondo questa valutazione dei rischi, ridurre la contaminazione durante la fabbricazione del formaggio a latte crudo di un fattore di log 3, log 4, o log 5 ridurrebbe il rischio medio di una persona immunocompromessa o di una donna incinta di ammalarsi di formaggio contaminato da L. monocytogenes. L’aggiunta di un antimicrobico sulla superficie del formaggio che potrebbe ridurre la contaminazione da L. monocytogenes di log10 2 CFU fornirebbe un rischio inferiore per gli individui immunocompremessi rispetto al consumo di formaggio senza trattamento antimicrobico. La natura ubiquitaria di L. monocytogenes ed il suo potenziale di contaminazione dei prodotti lattiero-caseari ha portato alla valutazione di diversi metodi per inibire l’agente patogeno nel latte e nei prodotti caseari. La lavorazione ad alta pressione come strategia di controllo ha il vantaggio di disattivare L. monocytogenes con il minimo danno per la qualità del formaggio. L’aggiunta di antimicrobici, compresi batteriocine e altre sostanze generalmente riconosciute come sicure, come gli acidi organici, è stata valutata per essere applicata da sola o in combinazione per ridurre la quantità di microrganismi necessaria all’ottenimento di un prodotto sicuro. Le colture protettive, comunemente batteri lattici, possono inibire la crescita patogena attraverso la produzione di acidi o batteriocine o la competizione per i nutrienti. Questa strategia dipende dalla matrice specifica del formaggio e dal modo in cui le colture prosperano nel suo ambiente a causa di fattori quali l’attività dell’acqua e il pH. La crescita di Listeria monocytogenes nel tempo è stata dimostrata in diversi esperimenti che hanno testato metodologie differenti per inibire il patogeno. È stato scoperto che L. monocytogenes aveva ancora il potenziale per crescere anche dopo il periodo di stoccaggio di 60 giorni richiesto per i formaggi a latte crudo e pastorizzato, il che significa che è necessario un metodo efficace per combattere questa crescita. La crescita di Listeria monocytogenes e il consumo di latte crudo o di formaggi contaminati possono rappresentare un grave rischio per la salute, soprattutto se i consumatori tendono a consumare alimenti non trasformati o minimamente trasformati. Alcuni consumatori considerano i metodi di produzione e gli ingredienti come “innaturali” o “artificiali“, causando difficoltà nell’aggiunta di trattamenti antimicrobici. Attualmente non esiste una definizione di etichetta semplice (clean-label) da parte dell’autorità di regolamentazione. I consumatori ritengono spesso che gli alimenti prodotti con un ingrediente artificiale non rientrino nella categoria di etichetta semplice.

Con i consumatori che si muovono verso una tendenza a desiderare etichette semplici, sono necessari, per questo tipo di etichette, i trattamenti antimicrobici nei prodotti lattiero-caseari che siano efficaci contro L. monocytogenes. Lactose oxidase (LO) è un enzima che molti consumatori considerano parte di un’etichetta semplice perché è un prodotto ottenuto da muffe del ceppo Microdochium nivale. Gli enzimi ottenuti da prodotti vegetali o microbici sono spesso utilizzati come coagulanti efficaci per il formaggio, per cui i consumatori possono essere indotti a considerare LO come presente in natura nei prodotti lattiero-caseari.

Lactose oxidase ossida il lattosio in acido lattobionico (LBA) poiché riduce contemporaneamente O₂ in H₂O₂. H₂O₂ è GRAS e può essere utilizzato come agente antimicrobico in diversi processi produttivi negli Stati Uniti. Nell’Unione Europea, l’H₂O₂è consentito solo come coadiuvante di trasformazione per alcuni alimenti, come lo sbiancamento del pesce, tuttavia, l’uso di glucosio ossidasi, un enzima che produce anche perossido di idrogeno è autorizzato come additivo in alcuni alimenti.

I risultati emersi in questa ricerca, hanno dimostrato che l’enzima Lactose oxidase potrebbe essere una potenziale strategia di prevenzione per L. monocytogenes per crescita dei prodotti lattiero-caseari liquidi.

Abstract

Listeria monocytogenes è un patogeno ubiquitario che può causare morbosità e mortalità in individui immunodepressi. La crescita di L. monocytogenes è possibile a temperature di refrigerazione a causa della sua natura psicrotrofica. L’utilizzo di antimicrobici nei prodotti lattiero-caseari è un potenziale metodo per controllare la crescita di L. monocytogenes in processi che non includono passaggi termici adatti a uccidere i microrganismi, in modo da aumentare la sicurezza di tali prodotti. Gli enzimi microbici offrono una strategia di etichetta semplice (clean-label) per controllare la proliferazione di L. monocytogenes. Lactose oxidase (LO) è un enzima derivazione microbica con proprietà antimicrobiche. Questo enzima ossida il lattosio in acido lattobionico e riduce l’ossigeno generando H₂O₂. Questo studio indaga gli effetti di LO nel latte scremato UHT utilizzando differenti scenari di contaminazione da L. monocytogenes. Questi trattamenti con LO sono stati applicati al latte crudo con varie modifiche; sono stati aggiunti maggiori livelli di LO così come integrazioni con tiocianato, per attivare il sistema di lattoperossidasi, un sistema presente nel latte di natura antimicrobica.

Lo scopo di questo studio è di valutare LO come antimicrobico nel latte inoculato con L. monocytogenes. La prima parte di questo studio ha esaminato l’efficacia dell’enzima LO sulla crescita di L. monocytogenes nel latte scremato UHT inoculato a log 2 CFU/mL e log 4 CFU/mL in un periodo di stoccaggio di 21 giorni. Questi risultati sono stati poi utilizzati per determinare se l’aumento delle concentrazioni di LO ha mostrato una migliore efficacia contro L. monocytogenes inoculato a log 3 cfu/mL e log 5 cfu/mL nel latte scremato UHT oltre 48 h. Infine, è stato valutato se LO inibisse la crescita di L. monocytogenes nel latte crudo, se conservato a temperature di refrigerazione.

Nel latte scremato UHT, ogni concentrazione di 0.0060, 0.012, e 0.12 g/L di LO riduce la conta di L. monocytogenes fino ad un numero sottostante il limite di rilevamento entro i 14 e 21 giorni di immagazzinamento refrigerato, e dipende dalla concentrazione di LO. Nelle 48 h di esperimenti per il latte scremato UHT, i trattamenti con LO sono stati effettivi in un modo dipendente dalla concentrazione.

La più alta concentrazione di LO negli esperimenti di 21 giorni, 0.12 g/L, non ha mostrato forte inibizione entro 48 h, ha raggiunto il livello di log 1.7 CFU/mL, con una riduzione di log 1.3 CFU/mL dall’inoculo iniziale, mentre il controllo è cresciuto di approssimativamente 4 log cfu/mL, un aumento di log 1 CFU/mL dall’inoculo del giorno 0. Quando è stata provata una sfida maggiore utilizzando un inoculo di log 5 CFU/mL, i trattamenti con 0.12 g/L e 1.2 g/L hanno ridotto i livelli da 0.2 a 0.3 log CFU/mL meno dell’inoculo iniziale e il trattamento con 12 g/L ha ridotto di log 1 CFU/mL in 48 h di stoccaggio a temperature di refrigerazione. Dopo che l’efficacia di LO è stata determinata nel latte scremato UHT, i trattamenti con LO sono stati applicati al latte crudo.

Le concentrazioni LO sono state aumentate, e l’aggiunta di tiocianato è stata valutata come integrazione dell’effetto del sistema di lattoperossidasi contro L. monocytogenes. Quando il latte crudo è stato inoculato con log 2 CFU/mL, 1.2 g/L di LO da solo e compianto con l’aggiunta di sodio tiocianato hanno ridotto di circa log 0.8 CFU/mL la carica dal momento dell’inoculo iniziale in 7 giorni di stoccaggio, mentre nel controllo la carica è cresciuta più di log 1 CFU/mL dall’inoculo iniziale. Inoltre, nell’inoculo più alto 1.2 g/L di LO combinato al sodio tiocianato hanno ridotto la conta di L. monocytogenes più di log 1 CFU/mL, mentre nel controllo è cresciuta di log 2 CFU/mL.

I risultati di questo studio suggeriscono che LO è un inibitore di L. monocytogenes nel latte scremato UHT e nel latte crudo. Perciò, LO può essere un trattamento efficace per prevenire la proliferazione di L. monocytogenes nei formaggi freschi e in altri prodotti lattiero-caseari. Questa strategia enzimatica è una nuova metodologia applicativa per controllare i patogeni alimentari come L. monocytogenes nei prodotti lattiero-caseari.